Электрофорез метод изучения клеток

Методы исследования химической организации клетки

Люминесцентная микроскопия.

Индукция с помощью ультрафиолетового света флуоресценции химических компонентов клетки (естественных или введенных извне).

Применяется для прижизненного выявления в клетке биохимических компонентов, способных к флуоресценции — витаминов, пигментов, гормонов, антибиотиков. Кроме того, с помощью синтетических флуорохромов, специфически взаимодействующих с определенными химическими компонентами клетки (ДНК, РНК, липидами и др.), исследуют их внутриклеточную локализацию.

Дифференциальное центрифугирование.

Центрифугирование смеси, полученной в результате разрушения клеток (ткани, органа), в специальных центрифугах при различных скоростях вращения ротора, что позволяет раздельно осаждать частицы с различной массой (ядра, оргаиеллы, макромолекулы). p>Применяется для получения чистых фракций различных субклеточных структур для последующего биохимического и биофизического исследований.

Электрофорез.

Движение заряженных частиц (макромолекул и др.), взвешенных в электролите, при наложении внешнего электрического поля; осуществляется в среде пористого наполнителя (хроматографическая бумага, гели); в зависимости от величины и знака заряда частиц они перемещаются к катоду или аноду и занимают совершенно определенное место (зону) (рис. 3.2).

Используется для разделения сложных смесей биополимеров — белков, нуклеиновых кислот и др.

Рентгеноструктурный анализ.

Основан на изучении дифракции, возникающей при взаимодействии рентгеновского излучения с кристаллическим образцом.

Рис. 3.2. Электрофореграмма смеси белков (каждому пятну соответствует определенная белковая фракция)

Применяется для исследования атомно-молекулярного строения биологических полимеров — пептидов, полисахаридов, нуклеиновых кислот.

5. Хроматография. Разделение смеси веществ за счет различий в их распределении в системе, состоящей из двух компонентов — подвижного (газовая или жидкая фаза) и неподвижного (твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе).

Основные разновидности: жидкостная, газовая, тонкослойная хроматография.

Читайте также:  Тамбовский кожно-венерологический диспансер - Физиотерапия в дерматологии

Используется для разделения и анализа смесей веществ, а также изучения их физико-химических свойств (массы и размеров молекул и др.).

Метод электрофореза в молекулярной биологии

Принципы гель-электрофореза

Метод электрофореза в геле использует разницу в размере и заряде различных молекул в образце. Образец ДНК или белка, подлежащий разделению, погружают в пористый гель, помещенный в ионную буферную среду. При приложении электрического поля каждая молекула, имеющая разный размер и заряд, будет проходить через гель с разной скоростью.

Пористый гель, используемый в этой технике, действует как молекулярное сито, которое отделяет большие молекулы от более мелких. Меньшие молекулы движутся быстрее по гелю, а более крупные медленнее. Подвижность частиц также определется их индивидуальным электрическим зарядом. Два противоположно заряженных электрода, которые являются частью системы, тянут молекулы к себе на основе их заряда.

Как это работает?

Гель, используемый в геле-электрофорезе, обычно изготавливают из материала, называемого агарозой, который представляет собой желатиновое вещество, экстрагированное из водорослей. Этот пористый гель можно использовать для отделения макромолекул разных размеров. Гель погружают в раствор солевого буфера в камеру электрофореза. Трис-борат-ЭДТА (ТВЭ) обычно используется в качестве буфера. Его основная функция — контролировать pH системы. Камера имеет два электрода — один положительный и другой отрицательный — на двух концах.

Образцы, которые необходимо проанализировать, затем загружают в маленькие лунки в геле с помощью пипетки. По завершении загрузки применяется электрический ток 50-150 В. Теперь заряженные молекулы, присутствующие в образце, начинают мигрировать через гель к электродам. Отрицательно заряженные молекулы движутся к положительному электроду, а положительно заряженные молекулы мигрируют к отрицательному электроду.

Скорость, с которой каждая молекула перемещается через гель, называется ее электрофоретической подвижностью и определяется главным образом ее чистым зарядом и размером. Сильно заряженные молекулы движутся быстрее, чем слабо заряженные. Меньшие молекулы работают быстрее, оставляя более крупные. Таким образом, сильный заряд и малый размер увеличивают электрофоретическую подвижность молекулы, а слабый заряд и большие размеры уменьшают подвижность молекулы. Когда все молекулы в образце имеют одинаковый размер, разделение будет основываться исключительно на их размере.

Читайте также:  Меновазин стоит копейки, а лечит 13 болезней! Почему я не знала этого раньше! Lifter

Трансиллюминатор

После завершения разделения гель окрашивается красителем, чтобы выявить полосы разделения. Бромид этидия представляет собой флуоресцентный краситель, обычно используемый в гелевом электрофорезе. Гель вымачивают в разбавленном растворе бромида этидия и затем помещают на УФ-трансиллюминатор для визуализации разделительных полос.

Полосы сразу проверяются или фотографируются для дальнейшего использования, поскольку они будут диффундировать в гель с течением времени. Краситель также может быть загружен в гель заранее, чтобы отслеживать миграцию молекул, как это происходит.

Применение гель-электрофореза

Гель-электрофорез широко используется в лабораториях молекулярной биологии и биохимии в таких областях, как судебная медицина, консервативная биология и медицина.

Ниже перечислены некоторые ключевые применения технологии:

  • При отделении фрагментов ДНК для отпечатков пальцев ДНК для расследования преступлений
  • Проанализировать результаты полимеразной цепной реакции
  • Проанализировать гены, связанные с определенной болезнью
  • В профилировании ДНК для проведения таксономических исследований для различения различных видов
  • При тестировании отцовства с использованием отпечатков пальцев ДНК
  • При изучении структуры и функции белков
  • При анализе устойчивости к антибиотикам
  • В методах блоттинга для анализа макромолекул
  • Изучая эволюционные отношения, анализируя генетическое сходство между популяциями или видами

Добавить комментарий Отменить ответ

Этот сайт использует Akismet для борьбы со спамом. Узнайте как обрабатываются ваши данные комментариев.

Двумерный электрофорез

  • Электрофорез двумерный — способ разделения сложных смесей белков, в котором сочетаются электрофорез белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и изоэлектрическое фокусирование. Этот метод увеличивает разрешение одномерного гель-электрофореза, а также позволяет исследовать неканонические структуры, возникающие в сверхспирализованной молекуле кольцевой ДНК. Оценить размер молекул помогут маркеры молекулярных масс. Последующая детекция на гельдокументирующих системах позволит визуализировать результат.

Реактивы для горизонтального электрофореза: агарозы, маркеры длин фрагментов ДНК, красители интеркалирующие для визуализации НК, красители для нанесения образцов на гель, буферы для электрофореза нуклеиновых кислот.

Читайте также:  Может ли жировик рассосаться сам по себе когда это возможно 1

Готовые полиакриламидные гели удобны в применении, разработаны под различное количество образцов (от 1 до 26 лунок) и адаптированы к различным по размеру электрофорезным камерам. Готовые стрипы для двумерного электрофореза доступны в широком спектре диапазонов pH, длиной от 7 до 24 см.

Для автоматического препаративного электрофореза — при отделении необходимого фрагмента автоматически — используются системы препаративного электрофореза для разделения и выделения ДНК/РНК/белков серии Pippin, производства Sage Science.

Другие типы электрофореза: вертикальный, горизонтальный, капиллярный, капиллярный на чипе.

Связанные понятия

Дот-блот — техника, используемая в молекулярной биологии для детекции различных макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты или белки. Данная техника является некоторым упрощением вестерн-блота: образцы, содержащие исследуемые макромолекулы наносятся сразу на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, минуя стадию предварительного электрофореза в ПААГ (в частности при работе с белками).

Тканевая матрица (ТМА, tissue microarray, тканевой мастер-блок, множественно-тканный парафиновый блок ) — в медицине, парафиновый блок-реципиент в который встроены множественные тканевые цилиндры, извлеченные из стандартных парафиновых блоков-доноров и организованные в виде упорядоченной последовательности (матрицы). ТМА позволяют сохранять и использовать ценные тканевые ресурсы более эффективно и экономично для гистохимического, иммуногистохимического (ИГХ) и молекулярного исследований.

MTT-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Другие близкородственные тетразолиевые красители: XTT, MTS и WST, которые используются в связи с промежуточным.

Ссылка на основную публикацию
Электросон польза и вред 1
Для чего назначают электросон и что это за процедура Одной из разновидностей физиопроцедур является электросон. Что это и каков принцип...
Экседрин при головной боли и мигрени, таблетки, 20 шт купить по выгодным ценам АСНА
Цитрамон-Боримед : инструкция по применению Описание Состав Фармакотерапевтическая группа Фармакологические свойства Показания к применению Противопоказания Способ применения и дозы Побочное...
Экселон — инструкция по применению, описание, отзывы пациентов и врачей, аналоги
Обзор пластыря Экселон: состав, инструкция, применение, стоимость, отзывы Для тех, кто столкнулся сам с таким недугом, как болезнь Альцгеймера эта...
Электростимуляция простаты трансректальная (1 сеанс) — Центральная клиника района Бибирево
Массажёр простаты Elite Electro Stim Массажёр простаты Elite Electro Stim Anal Fantasy Elite Electro Stim Prostate Vibe – это аппарат...
Adblock detector